胶原补片上生长因子释放及对人骨髓干细胞增殖与分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.020

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8474-8479.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.020

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胶原补片上生长因子释放及对人骨髓干细胞增殖与分化的影响

啜俊波¹，康凯¹，孙露¹，曲辉²，蔡俊¹，陈克功¹，谢宝栋¹，蒋树林¹，田海¹，李仁科¹

哈尔滨医科大学附属二院，¹心血管外科，哈尔滨医科大学心肌缺血机理与诊疗技术省部共建教育部重点实验室，²儿内科，黑龙江省哈尔滨市 150086

修回日期:2014-11-18 出版日期:2014-12-17 发布日期:2014-12-17
通讯作者: 康凯，博士后，副主任医师，副教授，硕士生导师，哈尔滨医科大学附属二院，黑龙江省哈尔滨市 150086
作者简介:啜俊波，男，1979年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，哈尔滨医科大学附属二院在读博士，主要从事组织工程心肌补片研究。
基金资助:
黑龙江省卫生厅课题资助项目(2013053)；国家自然科学基金(81471805)；中国博士后科研基金(2014M551272)；黑龙江省教育厅科研课题(12541434)

Release and effect of growth factors conjugated into collagen patches on human bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and differentiation

Chuai Jun-bo¹, Kang Kai¹, Sun Lu¹, Qu Hui², Cai Jun¹, Chen Ke-gong¹, Xie Bao-dong¹, Jiang Shu-lin¹, Tian Hai¹, Li Ren-ke¹

¹Department of Cardiovascular Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of Myocardial Ischemia Mechanism and Treatment (Harbin Medical University), Ministry of Education, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China; ²Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China

Revised:2014-11-18 Online:2014-12-17 Published:2014-12-17
Contact: Kang Kai, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Cardiovascular Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of Myocardial Ischemia Mechanism and Treatment (Harbin Medical University), Ministry of Education, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
About author:Chuai Jun-bo, Studying for doctorate, Department of Cardiovascular Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of Myocardial Ischemia Mechanism and Treatment (Harbin Medical University), Ministry of Education, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Project of Heilongjiang Health Bureau, No. 2013053; the National Natural Science Foundation of China, No. 81471805; the China Postdoctoral Science Foundation, No. 2014M551272; the Project of Heilongjiang Education Bureau, No. 12541434

摘要/Abstract

摘要：

背景：动物实验证明心肌细胞移植可改善心脏功能，但移植细胞效率较低，为减少移植细胞的流失，构建合适的移植载体与细胞共同移植于受体心脏已成为学界的共识。

目的：观察经碳化二亚胺法处理，共价结合生长因子胶原补片上生长因子的释放情况，以及其对人骨髓干细胞增殖与分化的影响。

方法：采用碳化二亚胺法将胶原补片激活后，对照组胶原补片直接保存于PBS内，实验组胶原补片继续浸于含有血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的PBS内，使其与生长因子共价结合，检测共价结合于胶原补片上生长因子的量；保存后1 d、3 d、7 d、2周、3周、4周，采用ELISA法检测上清液内血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的含量。将0.5×10⁶的人骨髓间充质干细胞均匀接种于两组补片上，采用苏木精-伊红染色计数细胞，MTT法及Brdu增殖实验对比补片上的细胞增殖情况；以RT-PCR法检测两组细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况，SMA免疫荧光染色对比两组补片上的细胞分化情况。

结果与结论：胶原补片上血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的共价结合率分别为42.4%，24.5%。保存4周内，胶原补片上的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子均呈现持续、缓慢的释放模式。与单纯胶原补片比较，共价结合生长因子的胶原补片可在体外有效促进人骨髓间充质干细胞的增殖并抑制其分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 心脏补片, 血管内皮生长因子, 碱性成纤维细胞生长因子, 细胞移植, 载体, 碳化二亚胺法, 生长因子, 缓释, 血管形成, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Preclinical trials in animals have demonstrated myocardial cell transplantation can improve heart function, but it is hindered by the low retention of transplanted cells. Therefore, it becomes a common strategy to generate a proper cell platform to promote cell retention and vasculature formation.

OBJECTIVE: To evaluate the cytokine release of a novel cytokine-conjugated collagen patch prepared with 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and its physiological effects on proliferation and differentiation of seeded human bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: After activating and crosslinking by EDC, the control patches (EDC-patch) were preserved in PBS and the experimental patches (GF-patch) were immersed into PBS containing vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor for cytokine conjugation. Collagen patches without EDC treatment underwent same process as internal control. ELISA was performed to detect the content of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the supernatant of GF-patch at 1, 3, 7 days, 2, 3, 4 weeks after patch preparation. The 0.5×10⁶ human bone marrow mesenchymal stem cells were evenly seeded on both kinds of patches and the cell proliferation was identified by hematoxylin-eosin staining followed by cell counting, MTT assay or BrdU staining test. Accordingly, cell differentiation was illustrated by RT-PCR for collagen I and collagen III expression, and immunofluorescent staining for SMA in seeding cells.

RESULTS AND CONCLUSION: 42.4% vascular endothelial growth factors and 24.5% basic fibroblast growth factors were successfully conjugated into collagen patches and they both exhibited the constant, controlled-release mode during the 4-week observation period. By contrast, the patch without EDC treatment just showed the physical bonding of both cytokines. In comparison with EDC-patch, GF-patch presented the capability to induce cell proliferation while retard cell differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: collagen, carbodiimides, vascular endothelial growth factors, fibroblast growth factor 2

中图分类号:

R318

啜俊波，康凯，孙露，曲辉，蔡俊，陈克功，谢宝栋，蒋树林，田海，李仁科. 胶原补片上生长因子释放及对人骨髓干细胞增殖与分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8474-8479.

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：体外组织工程心肌补片制备及生物学作用观察实验。

时间及地点：于2012年7月至2013年9月在哈尔滨医科大学心肌缺血省部共建重点实验室完成。

材料：

骨髓：取自哈尔滨医科大学附属二院心外科接受手术治疗的冠心病患者，年龄55-76岁，合并糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、肝炎及严重心力衰竭的患者除外。实验实施前已经哈医大二院伦理委员会批准(伦理号：2014-研- 010)，取材前均已签署知情同意书。具体取材方法和流程见文献[10-11]。

实验方法：

补片的制备：首先用专用模具将胶原海绵切成直径 5 mm的圆形补片，实验组补片浸泡于含有1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基硫代琥珀酰亚胺的PBS中20 min(室温)，使胶原补片活化、交联；随后将活化后的补片转移至含有VEGF和bFGF的PBS中2 h(室温)，使其与生长因子共价结合，用清洁PBS漂洗8次后保存于PBS中，4 ℃保存备用。对照组补片仅行碳化二亚胺法处理使胶原补片活化、交联就保存在PBS中。全部操作在无菌条件下完成。

解离曲线的测定：共价结合于胶原补片上的生长因子含量由加入反应液的生长因子(VEGF及bFGF均为150 ng)减去洗脱液中的生长因子含量间接获得，以未经碳化二亚胺法处理，浸于含有生长因子PBS中的胶原补片作为内对照。新鲜制备的共价结合生长因子的胶原片保存于PBS内，于保存后1 d、3 d、7 d、2周、3周、4周分别收集并检测保存补片的上清液内的生长因子含量。洗脱液及上清液内的生长因子含量利用相应的ELISA试剂盒检测获得。

骨髓间充质干细胞的分离及培养：肝素化前取骨穿液5.0-6.0 mL，注入装有4 mL淋巴细胞分离液的离心管中，密度梯度离心，取单个核细胞层，以1.6×10⁶移入含IMDM+体积分数10%FBS的培养瓶中，置入体积分数5%CO₂孵箱中37 ℃培养，长至80%融合时传代，取第3代细胞用于实验。

鉴定：取第3代细胞10⁵-10⁶个，4 ℃ 1 000 r/min离心 5 min，弃上清，100 μL cell staining buffer重悬细胞；在空白管、同型对照管、检测管分别加入50 μL cell staining buffer/同型抗体/实验抗体，轻轻混匀，避光孵育室温孵育20 min；孵育完成后，加入1 mL cell staining buffer，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，小心弃上清，用流式细胞仪检测，结果显示此种培养方法所取细胞，均能稳定阳性表达细胞表面抗原CD29、CD90、CD105，不表达白细胞共同抗原CD45及造血系标志物CD34和CD133。由此可以证明采用上述方法分离的单个核细胞为骨髓间充质干细胞^[10^，^12]。

细胞在补片上的种植及培养：首先，将上述实验组与对照组补片置于37 ℃、体积分数5% CO₂温箱内孵育30 min，然后用无菌吸纸将其吸干，转移并固定于自制的20 mm培养皿内。同时，消化离心培养好的骨髓间充质干细胞，以0.5×10⁶/补片的密度将细胞悬液分5点均匀接种于补片上，每个培养皿加入 100 μL培养液后置于温箱孵育40 min，待细胞在补片上贴附牢固后加培养液至浸过补片。每二三天更换培养液1次。

细胞增殖测定：

苏木精-伊红染色后计数细胞：细胞接种于补片后3， 7 d，分别将两组补片(n=5)浸于体积分数10%甲醛溶液中室温下固定24 h。石蜡包埋后切片，行苏木精-伊红染色。细胞计数按照双盲原则进行。请两位观察者分别于光学显微镜下随机选择5个视野行细胞计数。

MTT检测：将未接种细胞及接种有已知细胞数(0，0.2×10⁶，0.4×10⁶，0.8×10⁶，1.6×10⁶)的补片行MTT检查，测得的A值作标定曲线。接种后4 d进行MTT检测：即先将两种补片置于含有MTT工作液(1 g/L，500 μL/补片)的24孔板中，温箱孵育4 h，然后将其吸干，置入DMSO (500 μL/补片)中涮洗10 min，将洗脱液移至96孔板，620 nm分光光度计下计数，因形成的甲臜盐与具有代谢活性的骨髓间充质干细胞呈正比，故所得出的A值经标定曲线校正后即可得出活性细胞的数目。

Brdu增殖实验：接种24 h后，将10 mmol/L的Brdu溶液加入培养液，48 h后将补片速冻，制成冰冻切片，Brdu单克隆抗体免疫荧光染色，免疫荧光显微镜下观察Brdu染色情况，比较两组补片上处于增殖期(S期)细胞的比率，以间接推断细胞增殖情况。

细胞分化测定：

RT-PCR 检测两种补片细胞内Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的形成：接种4 d后，取出补片，速冻并将其研成粉末，采用TRIzol法提取出细胞内全部RNA后，将其置于含有特殊引物酶的聚合酶链锁反应液中扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离显影。人胶原引物酶序列为：Ⅰ型胶原，前向：5’aca gcc tcc aac tgc tcc ta3’，反向： 5’ cga agc ctc tgt gtc ctt tc3’； Ⅲ型胶原，前向：5’cac tgg tgc taa ggg aga gc3’，反向：5’ ctc cag cct ctc cat ctt tg3’。因胶原主要由成纤维细胞生成，故两种补片上细胞内的不同含量可以反映其向成纤维细胞分化的多少。

SMA免疫荧光染色：接种4 d后，将补片置于40 g/L多聚甲醛固定24 h，速冻并制成5 μm厚的冰冻切片后，行SMA免疫荧光(Santa Cruz，SC-6956)染色。按双盲原则在荧光显微镜下观察细胞SMA染色的阳性率，对比两组补片上骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的转化率。

主要观察指标：共价结合生长因子胶原补片上生长因子的释放情况及其对人骨髓干细胞增殖与分化的影响。

统计学分析：统计软件采用Graphpad 5.0，所有数值均以x(_)±s显示。苏木精-伊红染色细胞计数比较采用重复测量方差分析，其余细胞增殖及分化的指标比较均采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

迄今，虽然多组动物实验证明了心肌细胞移植对改善心脏功能的效果^[13-14]，但移植细胞效率低下却是一个公认的问题^[15]。有研究显示，采用心肌内直接注射的方式进行细胞移植，约90%的移植细胞将被循环血流冲走或自注射部位漏出，能存活下来的细胞不到10%^[2]，而有幸在局部存留下来的细胞也将有90%左右在移植后1周内死亡^[3]。因此采用何种方法来增加移植细胞的存留和存活就成为提高细胞移植效率必须面对的一个问题。为减少移植细胞的流失，构建合适的移植载体与细胞共同移植于受体心脏已成为学界的共识。各种天然的细胞外基质材料如胶原^[16]、粘连蛋白^[17]、Matrigel胶或hydrogel胶^[18-19]，以及某些天然材料如岩藻酸^[20]、壳聚糖等都曾作为移植细胞附着的生物载体用来改善细胞的存留^[21]。此外，移植载体的另一项重要作用是提供适宜细胞生存的三维结构，并加速移植细胞周围组织的再血管化进程^[22]。为达到上述目的，一系列生长因子或其组合被整合进移植载体，借以调控细胞的生理活动和再血管化进程^[23]。但由于多数生长因子的半衰期较短，单次局部给药并不能产生明显的药理效果；通过静脉或其他途径全身给药，又有诱发潜在肿瘤的风险。故建立一种可持续、稳定、局部给药的生长因子的释放平台就显得尤为重要^[24-25]。

当然，要想使生长因子与细胞载体稳定结合，单纯的物理附着是不够的。早期曾有学者用可溶性生长因子浸泡过的明胶海绵作细胞载体，发现效果并不理想；而近期Wu等^[26]的研究更证实与hydrogel胶化学结合的VEGF，会较物理结合的VEGF能更好促进梗死心肌的再血管化。

实验这里选择胶原海绵作为细胞载体，除了因为胶原海绵为人体天然的间质成分具有良好的组织相容性，天然的多孔隙性，合适的降解率及生物安全性等外^[9^，^27-28]，更关键的是利用碳化二亚胺法处理可激活其表面富含的羧基，相互交联或与多种生长因子共价结合，在增强了补片自身的机械性能的同时，又能使诸如VEGF、bFGF等生长因子与之稳定结合。本实验已证实，这种共价结合使得生长因子的释放相当稳定，而随着生长因子的释放和局部作用，种植于其上的骨髓间充质干细胞也发生了明确改变。可以推测，利用这一平台进行细胞的体内移植，极有可能会促进细胞周围组织的再血管化，为改善移植细胞的存活创造有利条件。

至于生长因子的选择，是基于如下考虑：①bFGF是一种强有力的有丝分裂原，具有强大的促多种成体干细胞分裂增殖的作用^[29]；Zhang等^[30]也证实VEGF可通过AKT-PKC信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖。②VEGF和bFGF在功能血管形成过程中具有强大的协同作用，可有效促进细胞周围组织的功能血管形成^[31]。而这反过来又会促进移植细胞的存活。当然，在本实验中仅证实了这一平台在体外对骨髓间充质干细胞的生理作用，至于体内研究结果，还需要进一步的观察和评价。

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